組織缺氧被認為是腎缺血再灌注損傷(IRI)中的重要事件，尤其是在缺血期間和再灌注后的最初幾小時內。然而關于IRI亞急性期腎氧合的知之甚少。我們采用四種不同方法評估了大鼠嚴重腎IRI亞急性期(再灌注后24小時和5天)組織氧合的時空變化。研究假設在雙側腎缺血1小時后的24小時和5天內，腎臟處于缺氧狀態，這是由于腎氧輸送(DO2)和氧消耗(VO2)之間的平衡被破壞所致。在IRI的亞急性期，腎DO2并未顯著降低。相比之下，再灌注后24小時腎VO2比假手術組減少了55%，再灌注后5天減少了49%。通過放射遙測技術測量的內髓組織PO2在缺血后24小時比假手術組高25±12%(平均值±標準誤)。再灌注后5天，組織PO2與假手術組大鼠的水平相近。通過克拉克電極測量的組織PO2在缺血后24小時持續高于假手術組，但在5天后無顯著差異。Unisense微電極能夠精確測量腎臟皮質和髓質不同深度的PO?值，為研究腎臟氧合的空間分布提供了詳細信息，驗證了腎臟在IRI亞急性期的氧合狀態，并支持了研究的主要結論。這種高分辨率的測量方法使得研究者能夠觀察到腎臟不同區域在IRI后的氧合變化，揭示了腎臟氧合的異質性。這種設備的高靈敏度和精確性使其成為研究腎臟氧合變化的重要工具。通過哌莫硝唑加合物免疫組化評估的細胞缺氧在這兩個時間點基本不存在，且組織缺氧誘導因子水平在腎缺血后下調。因此，在這種嚴重IRI模型中，組織缺氧似乎不是亞急性期的必然事件，可能是由于氧消耗顯著減少所致。未來的研究應進一步探討不同程度IRI模型中腎臟氧合的變化，以及這些變化與腎臟損傷和修復過程的關系。

Unisense微電極系統的應用

Unisense微電極（Clark電極）被用于測量腎臟組織氧張力（PO?），以評估腎臟在缺血再灌注損傷（IRI）后的氧合狀態。具體是使用了Unisense生產的50微米尖端直徑的Clark電極（型號OX-50）。大鼠在麻醉狀態下進行手術準備，包括氣管切開術、頸靜脈插管、動脈插管等，以確保實驗過程中動物的生理狀態穩定。將電極插入腎臟皮質，深度為2毫米，分別在腎臟表面的六個隨機位置進行測量。從腎臟皮質表面開始，以1毫米的增量逐步深入，直到10毫米深度，以評估腎臟不同深度的PO?變化。測量過程中，微電極通過微操縱器（馬達控制器）精確控制位置，確保數據的準確性和可重復性。精確測量了腎臟皮質和髓質不同深度的PO?值，為研究腎臟氧合的空間分布提供了詳細信息。通過測量腎臟組織PO?，發現再灌注后24小時，腎臟內髓和皮質的PO?顯著高于假缺血組，表明腎臟在IRI后并未出現預期的缺氧狀態。這一結果與放射遙測法測量的內髓PO?結果一致，進一步驗證了腎臟在亞急性期的氧合狀態。

圖1、腎缺血或假缺血后內髓組織PO2的時間變化。數值為大鼠接受一小時假缺血(5只)或雙側腎缺血(7只)后的平均值SE。手術前(第1天)和手術后(第0-5天)記錄組織PO2，以通過碳糊電極的電流進行評估。電流為每個24小時的平均值，并以手術前一天(第1天)平均值的百分比表示。Ptreatment、Ptime和Ptreatment*time是以治療和時間為因子的雙向重復測量方差分析的結果。

圖2、通過克拉克微電極評估組織PO2。首先將電極插入左腎皮層2毫米處的六個隨機位置。A：每只大鼠都進行了多次測量，不同的大鼠用不同的符號表示。封閉符號代表腎缺血大鼠(24小時內9只，5天內8只)，而開放符號代表假缺血大鼠(24小時內10只，5天內7只)。B：每只大鼠皮層組織PO2的測量值取平均值，并以鼠間平均值SE表示。B中，PTr、PT和PTr*T是以治療(Tr)和時間(T)為因子的雙向方差分析(ANOVA)的結果。每對列上方的P值和誤差條顯示的是學生非配對t檢驗的結果，使用Dunn-Sidak校正k=2進行保守調整，以考慮在24小時和5天進行比較的事實。C和D：缺血或假缺血恢復后24小時(C)或5天(D)，將電極從皮層表面以1毫米的增量推進到左腎10毫米處，建立組織PO2深度曲線。符號和誤差條是假缺血(○)或雙側腎缺血(實心○)1小時大鼠的平均值±SE。在C和D中，PD、PTr和PD*Tr是以深度(D)和治療為因子的雙向重復測量方差分析的結果。

圖3、雙側腎缺血或假缺血恢復24小時后腎臟切片的咪唑加合物免疫組化。圖片為每組六個腎臟皮質、外髓質和內髓質區域的典型圖像。

圖4、雙側腎缺血或假手術恢復5天后腎臟切片的咪唑加合物免疫組化圖。圖片為每組六個腎臟皮質、外髓質和內髓質區域的典型圖像。

圖5、雙側腎缺血或假缺血后缺氧誘導因子(HIF)蛋白的表達。假缺血(○)或雙側腎缺血(實心○)恢復后24小時和5天，大鼠左腎皮質、外髓質和內髓質組織提取物的HIF-1α(A-C)和HIF-2α(D-F)免疫印跡；每組n=6。G：電泳后凝膠的典型圖像。H：硝酸纖維素膜轉移后的典型圖像。

實驗結論

在嚴重腎缺血再灌注損傷（IRI）的亞急性期（再灌注后24小時和5天），腎臟并未出現明顯的缺氧現象。再灌注后24小時，腎臟內髓和皮質的組織PO?顯著高于假缺血組，表明腎臟處于相對高氧狀態。再灌注后5天，腎臟組織PO?恢復到與假缺血組相似的水平，未觀察到持續的缺氧現象。再灌注后24小時和5天，腎臟DO?未顯著降低，而VO?顯著減少（24小時減少55%，5天減少49%）。腎臟病理顯示，再灌注后24小時，腎小管細胞脫落和刷狀緣/頂膜破壞明顯；5天后，腎小管擴張，提示腎臟在IRI后存在一定的修復和適應過程。這表明腎臟氧合狀態的維持可能是由于氧消耗的顯著降低，而非氧輸送的增加。本研究的嚴重IRI模型中，腎臟在亞急性期并未出現明顯的缺氧現象，這可能與腎臟氧消耗的顯著降低有關。這一發現提示腎臟在IRI后的氧合狀態可能受到多種因素的影響，包括氧輸送和氧消耗的動態平衡。