背景介紹：研究了中國濃香型白酒生產過程中發酵谷物和窖泥（微生物群落之間的協同作用及其對有機酸合成的影響。濃香型白酒是一種以高粱等淀粉質原料為主要成分，通過多物種微生物發酵制成的蒸餾酒。發酵過程中，發酵谷物和窖泥作為微生物生長的兩個關鍵棲息地，其代謝分工尚不清楚。研究人員通過分析發酵過程中的環境變量、關鍵代謝物和微生物群落的變化，揭示這兩個棲息地微生物群落的協同作用機制。采用的研究方法包括樣本收集、環境變量和代謝物含量測定、DNA提取與定量實時PCR（qPCR）、Illumina MiSeq擴增子測序以及功能預測分析（PICRUSt）。樣本收集自四川瀘州老窖集團的泥窖，發酵周期為46天。研究發現，發酵谷物和窖泥在發酵過程中表現出不同的物理化學環境：發酵谷物呈酸性，乙醇含量高，而窖泥呈中性。乳酸主要在發酵谷物中積累，丁酸和己酸則主要在窖泥中產生。微生物群落結構分析顯示，細菌在發酵過程中占主導地位，且發酵谷物和窖泥的細菌群落結構有顯著差異。發酵谷物中的細菌群落多樣性在發酵過程中顯著下降，而窖泥中的細菌群落多樣性相對穩定。乳酸菌（Lactobacillus）在發酵谷物中占主導地位，而窖泥中以梭菌綱（Clostridia）為主，特別是氫孢菌屬（Hydrogenispora）。功能預測分析表明，參與乙酸和乳酸生物合成的酶主要富集在發酵谷物樣本中，而窖泥的細菌群落顯示出更大的丁酸和己酸合成潛力。體外模擬發酵實驗進一步驗證了Jiupei微生物群落在乙酸和乳酸生產中的作用，以及窖泥微生物群落將這些酸轉化為丁酸和己酸的能力。本研究表明，發酵谷物和窖泥微生物群落之間存在協同合作，共同推動了濃香型白酒中關鍵風味化合物的形成。這一發現不僅增進了對濃香型白酒發酵過程中微生物群落相互作用的理解，而且為通過調節微生物群落來改善白酒風味和質量提供了科學依據。

Unisense微電極系統的應用

Unisense微電極系統被用于監測發酵過程中發酵谷物和窖泥的氧氣含量變化。使用了OX-50型號的微電極傳感器來測量氧氣濃度。Unisense微電極系統被安裝在三維顯微操縱器上，并連接到微電極主機系統上，使用SensorTrace Pro軟件進行控制。能夠獲得在發酵過程中實時監測氧氣濃度的變化，更好地理解發酵過程中微生物的代謝活動和氧氣利用情況。

實驗結果

揭示了酒胚（發酵谷物）和窖泥在泥窖中由兩個空間相連的微生物生境組成，其環境條件顯著不同。宏基因組測序顯示，酒胚（發酵谷物）和窖泥中微生物群落的結構在發酵過程中存在顯著差異。乳酸菌在九皮的微生物群中占主導地位，而梭狀芽胞桿菌是坑泥中的主要細菌，主要包括氫孢菌屬、Sedimentibacter和Caproiciproducens。酒窖原位發酵和體外實驗表明，乳酸和乙酸主要由九皮微生物群產生，棲息在窖泥中的微生物負責合成己酸和丁酸。這些是與濃郁風味白酒相關的四種關鍵有機酸。這項研究表明，酒胚（發酵谷物）和窖泥中微生物群落內的合作推動了白酒發酵過程中關鍵風味化合物的形成。

圖1、人工奶酪樣品中，NaCl或水與奶酪混合后的滲透壓與水活性的關系。點表示觀察值的平均值，誤差條表示滲透壓的10次重復實驗和水活性的4次重復實驗的兩個標準差。

圖2、13.5°C下奶酪成熟過程中，奶酪表面微觀pH值的變化，A表示0.7厘米半徑的奶酪表面凸起處，B表示4.3厘米半徑的奶酪表面凹陷處。交叉點為觀察值（每個日期n=5），虛線表示建模的變異性區域的2.5%和97.5%分位數。

圖3、發酵谷物和窖泥微生物群落的β多樣性。酒窖聯盟的UPGMA聚類分析和PCoA分析。（A，C）細菌，（B，D）真菌

圖4、白酒發酵窖中不同微生物棲息地之間的細菌流動。（A）直方圖顯示了發酵谷物和窖泥樣品在發酵不同階段的共享OTU的相對豐度。（B）跟蹤酒平樣品在不同發酵階段共享OTU的Sankey圖（矩形的高度與OTU的數量相關）。（C）發酵谷物和窖泥中主要OTU的相對豐度動態。

圖5、觀察到的奶酪表面微觀水活性（aw）變異性，按表面和位置劃分。連接的點表示一個奶酪表面的累計分布函數（cdf），描述表面內位置的變異性（s location）。連接點分布的離散性說明了奶酪間或表面間的變異性（s surface）。實線為一個表面的水活性中位數cdf，虛線顯示了建模的表面間變異性區域的2.5%和97.5%分位數。

結論與展望

泥窖長期以來一直被用作中式濃香白酒發酵的厭氧生物反應器，其中淀粉原料（主要是高粱）被多物種微生物代謝成乙醇和各種風味化合物。發酵谷物和坑泥是泥窖中兩個空間相關的微生物棲息地，但它們的代謝分工仍不清楚。在這里研究人員研究了發酵過程中發酵谷物和窖泥中環境變量（如溫度、氧氣、pH值）、關鍵代謝物（如乙醇、有機酸）和微生物群落的變化。酒胚（發酵谷物）（低pH值、高乙醇）和窖泥（中性pH值）為微生物生長提供了兩個環境條件截然不同的棲息地。乳酸在發酵谷物中積累，而丁酸和己酸主要由棲息在窖泥中的微生物產生。

利用實時定量PCR的生物量分析表明，細菌在發酵過程中占微生物群落的主導地位，此外聚類和主坐標分析（PCoA）分析顯示酒胚和窖泥的細菌群落存在顯著差異。Unisense微電極系統被用于監測發酵過程中酒胚和窖泥的氧氣含量變化，研究人員能夠在白酒發酵過程中實時監測氧氣濃度的變化，從而更好地理解發酵過程中微生物的代謝活動和氧氣利用情況。酒胚中細菌群落多樣性在發酵過程中顯著降低，在窖泥中相對穩定。乳酸菌屬在發酵谷物中菌群落中占主導地位，其相對豐度在發酵結束時達到98.0%。梭狀芽胞桿菌（相對豐度：42.9-85.5%）是窖泥中最豐富的細菌，主要分布在氫孢菌屬（5.3-68.4%）。發酵谷物和窖泥的真菌群落表現出相似的演替模式，其中Kazachstania、Aspergillus和Thermoascus是優勢屬。PICRUSt分析表明，參與乙酸和乳酸生物合成的酶主要富集在九平樣品中，而窖泥中的細菌群落表現出更大的丁酸和己酸合成潛力。體外模擬發酵的分析進一步驗證了九平微生物群在乙酸和乳酸生產中的作用，這些酸隨后被坑泥微生物群代謝為丁酸和己酸。本研究工作證明了酒胚（發酵谷物）和坑泥微生物群落之間的協同合作，以形成濃郁風味的白酒的代表性風味。