4討論

多篇研究和綜述論文表明，土霉菌菌絲的形態發育是影響洛伐他汀產量的最重要因素之一。其重要性首先與底物(尤其是氧氣)的可用性有關，氧氣進入菌絲團聚體的運輸受到擴散的限制。由于真菌形態在土霉菌生產洛伐他汀過程中的重要性，MPEC被用于研究土霉菌生產洛伐他汀的過程。在這項工作中，MPEC被首次用于控制攪拌罐生物反應器中的真菌形態，該反應器同時以分批和連續補料模式運行。在此之前，這種方法僅用于搖瓶培養。

4.1形成洛伐他汀的最佳肉湯氧飽和度

目前的研究結果表明，在生產洛伐他汀的過程中，肉湯中的氧飽和度有一個最佳控制水平。此前，只有Lai等人研究了肉湯中氧飽和度在10%至40%范圍內的影響；他們發現分批實驗中的最佳值為20%。Casas Lopez等人和Rodriguez Porcel等人聲稱，肉湯中氧的飽和度越高(高達400%)，洛伐他汀的滴度越好，這就是他們使用富氧空氣生產洛伐他汀的原因。與此相反，Bizukojc和Ledakowicz警告說，持續的高通氣率可能會導致產生八酮副產物，如(+)-geodin。在目前的工作中，pO2=35%是連續分批補料工藝的最佳值，而40%(這些實驗中pO2的最高控制水平)是分批工藝的最佳值。然而，3.1節所述實驗中獲得的最佳洛伐他汀滴度并不令人滿意(即仍低于100mg LOV/l)，即使與我們之前在同一生物反應器中進行的pO2=20%的實驗相比也是如此。

這里得到的最佳pO2水平與Lai等人和Bizukojc和Ledakowicz報告的不同，可能有兩種解釋：第一，培養基成分不同；第二，從顆粒大小、顆粒結構和肉湯中游離菌絲的數量來看，土霉菌的形態發生了變化。在土霉菌生產洛伐他汀的過程中，人們很少關注肉湯中的碳源濃度與提供足夠的氧氣使其氧化的關系。Lai等人使用的培養基(即更高濃度的乳糖和酵母提取物)比我們在本研究中使用的培養基濃度更高。在上述Casas Lopez等人和Rodriguez Porcel等人的研究中，使用了超過100g LAC/l的培養基和富氧空氣，但作者并未顯示乳糖濃度隨時間的變化。只有Bizukojc和Gonciarz證明，可用氧氣和碳底物之間的比例是高效生產洛伐他汀的關鍵因素。重要的是，不僅要避免出現圖1G所示的分批培養現象，即乳糖缺乏導致洛伐他汀滴度下降，還要避免出現圖1I所示的分批補料培養現象，即過量補料碳底物。

將pO2維持在過高的水平可能會導致洛伐他汀的濃度過低，這是因為所需的高通氣速率和攪拌速度會對菌絲造成損害。在目前的工作中，pO2為40%的連續分批補料實驗就屬于這種情況，顆粒的崩解最終導致洛伐他汀滴度偏低。令人驚訝的是，文獻中很少涉及機械應力問題，只有Rodriguez Porcel等人以有限的方式比較了土霉菌在攪拌罐生物反應器和漿柱中的生長情況。他們跟蹤了這些類型的生物反應器中不同流體動力條件對顆粒直徑、蓬松度和生物量濃度的影響，但沒有提供有關洛伐他汀滴度的數據。

4.2顆粒內氧氣濃度對洛伐他汀產量的影響

只有在設定的20%氧氣水平下，才有可能保持纖毛蟲的顆粒形態，并獲得顆粒內氧氣濃度的數據。以前在搖床中進行的實驗中，只有直徑小于1400μm的最小顆粒才能完全被氧氣穿透。在這里的攪拌罐生物反應器中，即使在較小的顆粒(約1000μm)中也觀察到了零氧氣濃度，但只有在T01運行的緊密顆粒中才有。對于T02運行中較松散的顆粒，為避免顆粒中氧氣濃度為零而設定的直徑上限(約1400μm)大致得到了證實。Bizukojc和Gonciarz提出的最終結論，即通氣性更好的顆粒可確保更高的洛伐他汀滴度，在生物反應器系統中也得到了證實。

顆粒內氧濃度水平還與活性生物量有關，而活性生物量又與特定真菌產生代謝物和酶的能力有關。以前，通過對產生洛伐他汀和葡萄糖淀粉酶的曲霉進行圖像分析，量化了顆粒外層以及氧含量較高的層中的活性生物量。然而，在本實驗中，盡管培養前制備方法的改變導致了顆粒大小和結構的改變，但洛伐他汀滴度的增加并沒有預期的那么高。

綜上4.1和4.2，可以說培養液的通氣對洛伐他汀的生物合成非常重要，但真菌的形態是更重要的因素。Bizukojc和Ledakowicz以前曾在搖瓶中發現，顆粒的大小會影響洛伐他汀的生物合成。后來的研究和目前的實驗(其中測量了顆粒內的氧濃度曲線)證明，顆粒大小對洛伐他汀生產的影響是由于氧擴散的阻力和顆粒內的氧含量造成的。

4.3形態工程改善洛伐他汀的生產

上一節表明，有必要控制生物反應器中菌絲的大小。我們可以采用傳統的方法，如改變孢子數量或在生物反應器中誘導更高的剪切應力。第一種方法對土曲霉很有效。第二種方法在Casas Lopez等人的實驗中并不成功，因為將葉輪轉速從300轉/分鐘提高到800轉/分鐘會導致形成的被破壞顆粒變小，洛伐他汀滴度降低。如上所述，本文介紹的補料批次培養物中的洛伐他汀滴度降低是由于顆粒的破壞，尤其是在較高的pO2設置(40%)和長時間培養的情況下。

之前的MPEC搖瓶培養結果很有希望，因為當預培養液中滑石粉濃度為12g/l時，肉湯中的洛伐他汀濃度增加了一倍。在當前工作中進行的生物反應器研究中，分批系統中的洛伐他汀滴度也增加了一倍，但在甘油補料的連續補料式系統中，與對照運行相比，洛伐他汀滴度增加了3.5倍。分批補料培養是生產洛伐他汀的最佳系統，但這種長時間的培養過程很容易因長時間的機械應力而導致菌絲發生不希望看到的形態變化。Pawlak和Bizukojc的研究就證明了這一點。這些作者提出了各種補料方案，但沒有控制真菌形態。因此，他們獲得的洛伐他汀滴度低于100毫克LOV/l，這些滴度遠遠低于目前使用MPEC的工作中獲得的滴度。因此，對于洛伐他汀的生物合成來說，細胞內的氧氣濃度比培養液中的氧氣濃度更重要。反過來，細胞內氧濃度又取決于土霉菌顆粒的大小和結構。通過MPEC等技術確保形成小顆粒的土霉菌非常重要，這種技術可在孢子聚集階段提供適當的控制。試圖通過傳統的形態工程技術獲得小顆粒是沒有用的，例如增加攪拌以提供高剪切應力，從而破碎較大的顆粒。

5總結

可以得出四個重要結論。首先，培養液的氧飽和度是影響土霉菌生產洛伐他汀的一個重要因素。在某些過程中，提高氧飽和度可能會提高洛伐他汀滴度，除非維持高氧飽和度的方法會對真菌形態產生負面影響。其次，顆粒內氧氣濃度是可能影響土霉菌培養過程中葉伐他汀滴度的另一個參數。如果氧氣能更好地滲入顆粒，就能獲得更高的洛伐他汀滴度。第三，顆粒內的氧氣水平取決于土霉菌的形態，即顆粒的大小和結構。因此，菌絲的形態演變是影響洛伐他汀產量的最重要因素。第四，在攪拌槽生物反應器中由于剪切應力而形成的分散菌絲不能有效地生產洛伐他汀。只有使用微粒強化培養法，才能獲得穩定的小微粒，從而顯著提高洛伐他汀的滴度。因此，要想讓土霉菌高效地進行洛伐他汀的生物合成，真菌的形態學、菌體的大小、菌絲的大小和菌體的大小都是至關重要的。因此，要想讓土霉菌高效地進行洛伐他汀生物合成，必須在顆粒形成階段對真菌形態進行控制。