摘要

間歇性缺氧(IH)與阻塞性睡眠呼吸暫停(OSA)對心血管造成的后果有關(guān)。然而，由于缺乏合適的實驗系統(tǒng)，無法評估間歇性缺氧對內(nèi)皮是有害、保護還是兩者兼有。這項工作的目的是確定IH氧合波動的頻率和幅度對主動脈內(nèi)皮傷口愈合的影響。使用一種新型可控系統(tǒng)對人原代內(nèi)皮細胞單層進行損傷和恒定充氧(1%、4%、13%或20%O2)或不同頻率(0.6、6或60次/小時)和幅度范圍(13-4%O2或20-1%O2)的IH，24小時后測量傷口愈合情況。細胞單層修復(fù)在20%氧氣和13%氧氣條件下相似，但在4%氧氣的持續(xù)低氧條件下顯著增加(約兩倍)。IH的幅度和頻率在很大程度上調(diào)節(jié)了傷口愈合。在最低頻率(0.6次/小時)下，13%-4%O2的循環(huán)可使內(nèi)皮傷口愈合加快102%。然而，與13%-4%的氧氣振蕩相比，20%-1%氧氣振蕩的IH暴露會降低傷口閉合速度(在6個周期/小時和0.6個周期/小時時分別降低74%和44%)。模擬嚴(yán)重OSA的高頻IH模式(60次/小時)并未顯著改變內(nèi)皮傷口的閉合，與氧合周期振幅無關(guān)。總之，間歇性缺氧IH中低氧循環(huán)的頻率和幅度會明顯改變傷口愈合反應(yīng)，并成為決定細胞在OSA中如何反應(yīng)的關(guān)鍵因素。

最新與值得關(guān)注

間歇性缺氧(IH)會對阻塞性睡眠呼吸暫停(OSA)患者的心血管造成影響。然而，以往在與OSA相關(guān)的實驗研究中采用的各種頻率和嚴(yán)重程度的IH導(dǎo)致了對IH影響結(jié)果的爭議。通過采用優(yōu)化的IH實驗系統(tǒng)，我們提供的證據(jù)表明，間歇性缺氧IH的頻率和程度明顯改變了人體主動脈內(nèi)皮的傷口愈合，成為決定細胞在OSA中如何反應(yīng)的關(guān)鍵因素。

引言

阻塞性睡眠呼吸暫停(OSA)是一種非常普遍的呼吸系統(tǒng)疾病，可能會對神經(jīng)認知、代謝、腫瘤和心血管造成不良后果。間歇性缺氧(IH)是由OSA患者上氣道反復(fù)塌陷和重新開放引起的，是這種夜間呼吸障礙的主要有害挑戰(zhàn)之一，與OSA的許多病癥有關(guān)。然而，IH也被認為是通過誘導(dǎo)和促進細胞和器官的預(yù)處理而起到潛在保護作用的因素。事實上，關(guān)于IH對心血管的具體影響一直存在著激烈的爭論。雖然IH會誘導(dǎo)釋放活性氧和炎癥介質(zhì)，從而損害血管內(nèi)皮功能，導(dǎo)致動脈粥樣硬化，但IH也可能通過激活以誘發(fā)預(yù)處理為重點的適應(yīng)性反應(yīng)來發(fā)揮心臟保護作用和治療作用。因此，關(guān)于持續(xù)氣道正壓療法(或CPAP)對OSA患者心血管影響的先驗結(jié)論相互矛盾，其原因可能在于IH的多態(tài)性，這一話題在過去幾年中引起了廣泛關(guān)注和爭論。盡管人們一直認為周期性缺氧的程度和頻率在IH對心血管系統(tǒng)的保護或損害作用中起著關(guān)鍵作用，但使天平傾向一方或另一方的IH特征的確切界限尚不清楚。

細胞培養(yǎng)是研究IH潛在影響的一種有價值的實驗方法，因為與動物模型不同，細胞培養(yǎng)可以選擇性地、精確地將細胞置于所選擇的IH模式下。然而，由于缺乏合適的實驗系統(tǒng)，無法在體外細胞中應(yīng)用控制良好的IH模式，研究模仿OSA的IH如何調(diào)節(jié)細胞行為的工作一直受阻。最近，研究IH對細胞影響的方法學(xué)難題得到了解決，即在透氣薄膜上培養(yǎng)細胞，允許氧氣從膜下空間快速擴散到細胞。這種實驗方法可以在振幅和頻率方面對細胞應(yīng)用精確控制的IH模式。鑒于我們有興趣研究控制良好的模擬OSA的IH對細胞的影響，并且有合適的實驗環(huán)境，本研究的目的是檢驗氧分壓變化的頻率和每個周期中達到的最大和最小氧值對細胞反應(yīng)的特征起重要作用這一假設(shè)。更具體地說，我們使用一種模擬內(nèi)皮修復(fù)的經(jīng)典傷口閉合實驗來評估這一假設(shè)，并研究輕度和重度OSA對應(yīng)的兩種實際IH頻率(分別為6次和60次呼吸暫停/小時)對損傷后內(nèi)皮細胞單層修復(fù)的影響。對于每種頻率，我們還研究了兩種氧分壓高低范圍的影響：20%-1%的氧氣波動(這是基于IH的細胞研究中使用的原型)和13%-4%的氧氣波動(這相當(dāng)于OSA患者主動脈內(nèi)皮細胞所經(jīng)歷的更真實的氧張力值)。事實上，在正常通氣和氣體交換條件下，如果沒有發(fā)生呼吸暫停事件，動脈血中的氧分壓(PaO2)約為100mmHg(即13%O2)。假設(shè)在嚴(yán)重OSA事件中動脈血氧飽和度(SaO2)可達到約60%的最低點，則相應(yīng)的PaO2將為約30mmHg，相當(dāng)于4%的氧氣。

方法

細胞培養(yǎng)。從美國類型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得的人原代主動脈內(nèi)皮細胞(HAEC)常規(guī)生長在血管細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基補充了內(nèi)皮細胞生長試劑盒-VEGF(ATCC)和抗生素/抗真菌溶液，抗生素/抗真菌溶液的最終濃度為10U/ml青霉素、10g/ml鏈霉素和25g/ml兩性霉素B。實驗前，將細胞培養(yǎng)物保存在T-25組織培養(yǎng)瓶中，置于20%O2，5%CO2和37℃的標(biāo)準(zhǔn)加濕培養(yǎng)箱中。在使用下述體外系統(tǒng)進行實驗時，使用的是混合度為75%的第4和第5代培養(yǎng)物。

IH體外應(yīng)用的實驗環(huán)境。在體外細胞暴露于恒定或可變氧氣濃度(IH)的實驗中，采用了一種定制的實驗裝置，該裝置由一個聚二甲基硅氧烷(PDMS)系統(tǒng)組成，該系統(tǒng)是根據(jù)之前的設(shè)計改良而成的。設(shè)計的裝置以直徑20毫米的PDMS孔為基礎(chǔ)，孔內(nèi)有90μm厚的透氣PDMS膜(圖1A)。孔的底部與氣源相連，通過薄膜的直接擴散，使恒定的混合氣體或循環(huán)變化的氣體成分循環(huán)到膜頂部培養(yǎng)的細胞中。PDMS孔是用Autodesk 123D設(shè)計軟件設(shè)計的陰性聚乳酸模具制成的，并用Ultimaker-2 3D打印機打印出來。簡而言之，將PDMS混合物倒入陰模中，然后用真空罐去除氣泡，再將混合物放入65℃的烤箱中烘烤3小時，使PDMS固化，然后從模具上剝離PDMS，得到復(fù)制品。另一方面，PDMS膜是按照之前描述的方案在硅晶片上制作的。為了獲得90μm厚的膜，將PDMS混合物倒在晶片中心，以1,000rpm的轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)1分鐘。

圖1細胞暴露于恒定或可變氧氣濃度的體外實驗系統(tǒng)。A：對培養(yǎng)細胞進行受控間歇性缺氧(IH)的細胞培養(yǎng)設(shè)置示意圖(解釋見正文)。B：以60次/小時的頻率進行不同量級的IH(20-1%O2(藍線)和13-4%O2(黑線))時，在膜頂部(細胞培養(yǎng)層)測得的實際氧氣濃度。C：以60次/小時(黑線)和6次/小時(紅線)的頻率施加13-4%O2的IH時，在膜頂部(細胞培養(yǎng)層)測得的實際氧氣濃度。每個時間軸的顏色與相應(yīng)的線相關(guān)聯(lián)。B和C中的信號在時間上有所偏移，以便于視覺比較。

為了確認氣體刺激在頻率和振幅方面從氣體攪拌器正確傳遞到培養(yǎng)細胞，所有用于體外實驗的培養(yǎng)系統(tǒng)都在使用前進行了校準(zhǔn)。使用氧氣微傳感器(Unisense)測量膜頂部(細胞培養(yǎng)層)的氧氣濃度顯示，系統(tǒng)平衡時間約為7秒，從而驗證了應(yīng)用不同IH模式(包括模擬OSA的高頻模式)時實驗設(shè)置的正確顯示(圖1，B和C)。如圖所示，改變氧氣失飽和的頻率會改變失飽和和再飽和的持續(xù)時間。雖然這種IH模型并不能完全模擬OSA患者在不同呼吸暫停指數(shù)下的實際缺氧/復(fù)氧時間，但它再現(xiàn)了大多數(shù)IH實驗中的循環(huán)模式。