在開始實驗之前，我們檢查了充氧循環(huán)是否會引起細胞水平的測量溫度或拉伸發(fā)生變化。

內(nèi)皮傷口愈合試驗。在進行細胞培養(yǎng)實驗前，按照之前的報道對培養(yǎng)孔進行紫外線滅菌，并在膜表面涂上0.1mg/ml膠原I。然后在培養(yǎng)室的每個孔中加入在1毫升完全生長培養(yǎng)基中含有約110,000個HAEC的懸浮液。每孔中播種的細胞來自T-25燒瓶中生長的HAEC亞培養(yǎng)物的胰蛋白酶化。細胞播種后，在20%氧氣、5%二氧化碳和37℃的濕潤細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到細胞達到匯合(16小時)。然后，用無菌的200μl移液管吸頭劃傷內(nèi)皮細胞單層，并用1×PBS沖洗去除細胞碎片。隨后，棄去PBS，取而代之的是完全生長培養(yǎng)基。最后，將培養(yǎng)裝置置于帶溫度控制(37℃)的培養(yǎng)箱中，并連接到氣體攪拌器，使細胞暴露于恒定(1%、4%、13%或20%O2)或不同頻率(0.6、6或60個周期/小時)和量程范圍(13-4%O2或20-1%O2)的氧氣濃度循環(huán)變化中24小時(所有情況下二氧化碳濃度均保持在5%)。對于任何給定的條件，都包括一個平行對照組(持續(xù)13%的氧氣，5%的二氧化碳)，以進一步規(guī)范傷口愈合率。每個實驗組的傷口愈合測量在六個不同的日子里重復進行(n=6/實驗組)。

為評估內(nèi)皮傷口愈合過程，在劃傷后(0小時)和實驗結束后(24小時)立即測量傷口面積。為此，將培養(yǎng)系統(tǒng)放置在配有電荷耦合器件相機(C9100)的倒置顯微鏡的電動平臺上，使用10倍物鏡記錄每個孔的相位對比圖像。鑒于宏觀內(nèi)皮傷口大于單個圖像區(qū)域的面積，因此通過NIS軟件v4.10.00中相應工具自動獲取的九個相鄰區(qū)域的復合生成來獲得完整的傷口圖像。使用ImageJ軟件(http://imagej.nih.gov/ij/)測量，通過比較每個內(nèi)皮傷口的初始面積和最終面積來評估傷口閉合情況。簡而言之，由一名不知道治療組的研究人員使用自由選擇工具在所有圖像中標記傷口邊緣。測量每個樣本在兩個不同時間點的傷口面積，并計算傷口閉合的百分比變化。對于每種實驗條件，通過將面積變化百分比與連續(xù)暴露于13%O2的細胞對應的面積變化百分比進行歸一化，計算出傷口閉合指數(shù)。

結果

圖2內(nèi)皮傷口愈合試驗。相位對比圖像示例，顯示實驗開始時(t=0小時)和細胞培養(yǎng)24小時后，在持續(xù)暴露于13%O2氧氣(上圖)和4%O2氧氣(下圖)條件下的細胞單層傷口。黃線和紅線分別表示初始和最終傷口邊界。在這個具有代表性的例子中，氧氣濃度為13%時，傷口閉合面積減少了20.5%，氧氣濃度為4%時，傷口閉合面積減少了44.7%。比例尺為500μm。

圖2舉例說明了培養(yǎng)物暴露于13%O2和4%O2時的內(nèi)皮傷口愈合過程，顯示24小時后，細胞單層修復在缺氧條件下得到加強。內(nèi)皮單層最初形成的傷口寬度重復性很強：總體為1.033±0.016mm(平均值SE)，比較不同實驗組(間歇缺氧的頻率和幅度)，未觀察到初始傷口寬度的顯著差異。

圖3恒定氧氣濃度下的內(nèi)皮傷口閉合指數(shù)。與作為對照的13%氧氣相比，細胞暴露于4%氧氣時傷口愈合率明顯增加。

圖3顯示了恒定氧合水平下的分組結果。雖然內(nèi)皮修復在20%O2和13%O2濃度下總體相似，但在4%O2濃度下，內(nèi)皮修復出現(xiàn)了相當大的增長(約兩倍)。然而，雖然在1%氧氣濃度下觀察到了類似的傷口閉合反應(與13%氧氣濃度相比，有增加38%的趨勢)，但它顯著低于4%氧氣濃度(26%)(P=0.036；n=6/實驗組)。

圖4間歇性缺氧(IH)下的內(nèi)皮傷口閉合指數(shù)。間歇缺氧的頻率和振幅范圍都會引起傷口愈合的顯著變化。低頻IH(0.6次/小時)加速了4-13%幅值范圍內(nèi)的內(nèi)皮傷口愈合，而模擬嚴重OSA的高頻IH模式(60次/小時)并沒有明顯改變傷口閉合，與氧氣水平無關。數(shù)據(jù)歸一化為連續(xù)13%氧氣條件下的數(shù)據(jù)。

內(nèi)皮傷口閉合顯示出很大的差異，這取決于IH挑戰(zhàn)的幅度和頻率(圖4)。與參考值(恒定13%氧氣)相比，以0.6次/小時的最低頻率使用13%-4%氧氣波動的循環(huán)可使內(nèi)皮傷口愈合加快102%(P=0.009)。圖4還顯示，當IH采用20-1%的周期性氧合擺動時，與13-4%的擺動相比，傷口閉合率有所降低。更具體地說，在6個周期/小時和0.6個周期/小時時，傷口閉合率分別降低了74%(P<0.001)和44%(P=0.029)。模擬嚴重OSA的高頻IH模式的事件發(fā)生率(60次/小時)并未顯著改變內(nèi)皮傷口的閉合，無論氧合擺動幅度如何(即20-1%或13-4%O2)。

討論

這項研究提供了初步證據(jù)，證明細胞培養(yǎng)模型中的主動脈內(nèi)皮傷口愈合受到用于模擬OSA的特定IH范例的很大影響。值得注意的是，研究結果表明，氧壓振蕩的頻率和范圍在細胞對損傷的集體反應中起著重要作用。

IH對細胞的影響已通過多種缺氧/復氧模式進行了評估，同時采用了改變培養(yǎng)物上方氣室中氧氣濃度的傳統(tǒng)方法。然而，由于氧氣在液體培養(yǎng)基中的擴散速度較慢，這種方法只能可靠地應用非常低的循環(huán)速率(通常為幾分鐘到幾小時)，這與OSA患者典型的缺氧/復氧事件頻率明顯不同。此外，在細胞培養(yǎng)的常規(guī)IH環(huán)境中實施與OSA相關的循環(huán)速率會導致細胞PO2水平與細胞培養(yǎng)系統(tǒng)空氣空間中的PO2水平大相徑庭，從而提供誤導性的研究結果和結論。因此，除了作者實際控制或測量細胞水平氧合的少量研究外，迄今為止還沒有廣泛研究過OSA相關頻率下IH對細胞的影響。最近設計的一種實驗方法可以精確控制定義IH曲線的細胞氧合參數(shù)(圖1)，它使我們能夠證實一個假設，即內(nèi)皮傷口愈合實驗中的細胞反應明顯依賴于IH特性。此外，我們還探索了各種模擬嚴重(60次/小時)和輕度(6次/小時)OSA的IH頻率，以及與之前一些報告中采用的IH頻率類似的非常慢的頻率(0.6次/小時)。如此低的IH循環(huán)頻率事實上并不是在模擬OSA，而是在模擬氧合變化，如腫瘤內(nèi)發(fā)生的氧合變化。另一方面，我們研究了不同的缺氧/復氧振幅范圍：一個是文獻中常用的范圍(20-1%O2)，另一個是與嚴重OSA時主動脈內(nèi)皮細胞體內(nèi)氧擺動條件相吻合的范圍(13-4%O2)。

在不同恒定氧合水平下獲得的內(nèi)皮傷口愈合反應(圖3)表明，與正常氧合水平(13%O2)相比，在OSA(4%O2)的實際但非常嚴重的缺氧值下，內(nèi)皮修復顯著增強。然而，值得注意的是，在1%O2的缺氧水平下，傷口愈合明顯低于4%O2的水平，而這一水平是一些IH研究中通常假設的，但即使在嚴重OSA中，對于大動脈內(nèi)皮來說也是不現(xiàn)實的。因此，我們的研究結果表明，內(nèi)皮傷口愈合的細胞反應與測試反應的缺氧嚴重程度并不成正比。因此，我們的研究結果可以作為一個說明性例子，反對缺氧程度越深，細胞反應越強的簡單概念。這些來自持續(xù)缺氧的數(shù)據(jù)還指出了在與每種細胞類型和體內(nèi)龕位的微環(huán)境相類似的氧飽和度值下測試細胞的重要性?？紤]到生理正常氧合水平明顯取決于相關組織，從骨髓的1%到肺泡上皮細胞和動脈內(nèi)皮細胞的13%不等，這一點尤為重要。因此，傳統(tǒng)實驗假設大氣中的氧氣濃度為20%O2相當于細胞的常氧狀態(tài)顯然是有問題的，因為對于幾乎所有培養(yǎng)細胞來說，從生理角度來看，這種氧合水平顯然是高氧的。具體到內(nèi)皮細胞，值得注意的是，13%的氧氣水平對動脈內(nèi)皮來說是合理的常氧水平，但對通常處于40mmHg氧壓(~5%)的靜脈內(nèi)皮來說卻是生理性高氧水平，而且這種水平實際上相當于OSA中動脈內(nèi)皮所經(jīng)歷的最嚴重缺氧。在這方面，值得注意的是，在間歇性缺氧的動物中，對于周期性動脈氧飽和度降低的幅度，細胞微環(huán)境中的局部分壓水平因組織/器官(如腦、肝、肌肉、脂肪和睪丸)的不同而有很大差異。

本研究最重要的發(fā)現(xiàn)是傷口愈合率在很大程度上取決于IH模式(圖4)。當細胞處于OSA(13%-4%O2)下主動脈內(nèi)皮細胞的實際氧合波動時，極低(0.6次/小時)的修復率是正常氧合水平(13%O2)的兩倍。有趣的是，當循環(huán)速率接近重度OSA(60次/小時)時，傷口愈合與常氧對照相似，這表明快速缺氧循環(huán)并不一定意味著更高的細胞反應。值得注意的是，當缺氧擺動幅度(20%-1%O2)比OSA中這種特殊細胞類型的實際擺動幅度(13%-4%O2)更大時，內(nèi)皮細胞的恢復往往會減弱，尤其是在0.6和6個周期/小時的頻率下。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)并不支持IH波動越劇烈，細胞反應越強的觀點。為此，圖4提供了一個視角，說明內(nèi)皮傷口愈合的進展如何因IH范例而異(傷口閉合指數(shù)大約在四倍范圍內(nèi)變化)。換句話說，由于IH的這些頻率和振幅范圍涵蓋了以前在OSA文獻中使用的一些實驗條件，如果不注意特定的周期性缺氧條件，可能會得出相互矛盾的結論：IH可能對內(nèi)皮修復有益、有害或沒有任何影響(圖4)。因此，通過微調(diào)IH實驗條件獲得的結果強烈表明，至少在OSA領域的體外研究中，需要精確劃分細胞所經(jīng)歷的IH的確切模式，IH模式的選擇應盡可能模擬每種細胞類型在體內(nèi)所經(jīng)歷的病理生理氧合條件。

在對OSA中的細胞反應提出的許多具體相關問題中，我們選擇了主動脈內(nèi)皮傷口愈合范例作為例子，而不是試圖闡明與任何特定OSA相關的發(fā)病機制，主要目的是確定細胞反應對IH范例的依賴程度。心血管改變是增加OSA患者發(fā)病率和死亡率的最重要后果之一。特別是，實驗和臨床研究都清楚地表明，內(nèi)皮細胞會受到IH的影響，但肥胖、年齡和同源性反應等其他因素也會發(fā)揮作用。在這種情況下，要保持正常的內(nèi)皮結構和功能，就需要修復機制能夠正常運行并對損傷做出適當反應。我們在體外研究中獲得的結果表明，就修復過程而言，IH和持續(xù)低氧似乎都能在全球范圍內(nèi)發(fā)揮保護作用(但有很大程度的可變性)，傷口愈合的整體增加就是證明。至于內(nèi)皮傷口愈合的基本機制如何受到周期性缺氧/復氧的頻率和程度的影響，還需要等待進一步的研究，這顯然超出了本研究的范圍。

盡管如此，我們?nèi)杂斜匾喴仡櫜母拍钌嫌懻摬煌姆磻侨绾胃鶕?jù)具體的缺氧模式而發(fā)生的。內(nèi)皮傷口愈合與其他多種細胞生理反應類似，是一個機制非常復雜的過程，尤其是在隨時間變化的微環(huán)境條件下。簡單地說，細胞單層修復涉及兩個主要的一般細胞過程(遷移和增殖)。體內(nèi)內(nèi)皮傷口愈合的數(shù)據(jù)表明，細胞遷移先于細胞增殖，在本研究實驗的時間范圍內(nèi)(24小時)，傷口愈合主要是由細胞遷移引起的。然而，細胞遷移和增殖都是由多個分子級聯(lián)的上調(diào)/下調(diào)驅動的，而每個細胞內(nèi)的氧合時間過程會進一步影響這些分子級聯(lián)。就心血管系統(tǒng)的具體情況而言，據(jù)報道，上游和下游生物標志物都會受到IH的調(diào)節(jié)，而且在某些情況下會受到與持續(xù)缺氧不同的調(diào)節(jié)。低氧誘導因子(HIF)1和2以及NF-B都會通過調(diào)節(jié)氧化應激和炎癥途徑以及內(nèi)皮細胞的細胞凋亡對IH做出反應。此外，IH還會引起促炎細胞因子和脂肪因子的基因表達和分泌發(fā)生變化，影響一氧化氮偶聯(lián)、內(nèi)皮素-1和內(nèi)皮素受體，并增加血管內(nèi)皮生長因子的循環(huán)水平。在IH的這種情況下，每個細胞對時變環(huán)境的反應可能涉及慢反應和快反應機制，它們分別主要由整個周期的平均缺氧程度以及缺氧循環(huán)的速率和幅度驅動。事實上，有研究表明，在一些細胞中，上游反應因子(如HIF-1和HIF-2)可分別對恒定缺氧或循環(huán)缺氧做出選擇性反應。此外，再氧合的持續(xù)時間會調(diào)節(jié)小鼠氧化應激的誘導。因此，隨著循環(huán)頻率的增加，慢反應機制的相對重要性會降低，而快反應機制則會產(chǎn)生相反的效果。還應考慮到，除循環(huán)頻率外，細胞氧分壓的最大值和最小值也可能調(diào)節(jié)細胞反應的程度，這可能解釋了為什么頻率的增加會因缺氧/再氧的擺動范圍不同而產(chǎn)生不同的效果(圖4)。在主動脈內(nèi)皮細胞的特殊情況下，我們發(fā)現(xiàn)除了最高的IH頻率(60次/小時)外(缺氧時間可能不足以發(fā)生轉錄變化)，傷口愈合只對這些細胞在體內(nèi)經(jīng)歷的范圍內(nèi)的氧合機制有反應。具體來說，從13%的生理值到嚴重病理情況下動脈血水平的合理預期值(低至4%)。有趣的是，這種增強內(nèi)皮修復的"甜蜜點"對于連續(xù)性和IH都是存在的。

然而，除了IH在單個細胞中引發(fā)的反應外，多細胞的綜合集體反應也在傷口愈合中發(fā)揮作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)，在參與炎癥反應的重要上游因子(如NF-B)中，動態(tài)刺激(振蕩輸入和生物噪聲)可在很大程度上調(diào)節(jié)全球綜合細胞反應。此外，最近也有報道稱，由于涉及細胞間的交流，驅動細胞集體遷移(如傷口愈合的基礎機制)的機制與驅動孤立細胞遷移的機制并不完全相同。由于細胞交流機制(即細胞-細胞接觸、通過細胞骨架收縮在細胞外基質(zhì)中傳遞張力或旁分泌)表現(xiàn)出特定的時間反應特征，因此有理由期待氧合的動態(tài)條件也能調(diào)節(jié)綜合的集體傷口愈合細胞反應的時間特征。遺憾的是，我們目前對細胞集體反應所涉及的不同機制如何受動態(tài)氧合變化調(diào)節(jié)的了解幾乎為零，因為大多數(shù)研究都集中在單細胞個體途徑或恒定氧合條件下的集體過程。最后，應該考慮到的是，在體內(nèi)，細胞對IH的反應不僅是這種挑戰(zhàn)對細胞直接引起的反應，而且還通過循環(huán)可溶性因子或免疫細胞釋放到血液中的間接影響作為對IH的全身反應。在這方面，以前有關內(nèi)皮細胞的數(shù)據(jù)清楚地表明，用反復氣道阻塞的大鼠或睡眠呼吸暫?；颊叩难迮囵B(yǎng)細胞，可調(diào)節(jié)傷口愈合。考慮到仍有許多問題有待解決，我們相信，目前實驗中采用的實驗方法應能幫助未來的研究闡明精確定義的IH范式如何調(diào)節(jié)單個和集體的綜合細胞反應過程。

總之，這項研究強調(diào)了在模擬OSA的大量IH特征的背景下，與內(nèi)皮細胞修復反應相關的深遠差異，進一步強調(diào)了精確劃分每時每刻細胞氧合特征的重要性。此外，我們在主動脈內(nèi)皮細胞傷口愈合中的發(fā)現(xiàn)強烈表明，有必要調(diào)整實驗IH范例，以可靠地再現(xiàn)影響體內(nèi)每種特定細胞類型的缺氧水平。