方法

動(dòng)物

42只10周齡的雌性Sprague-Dawley大鼠來自上海SLAC實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。食物和水自由供應(yīng)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案均經(jīng)上海體育大學(xué)和第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

胎盤早剝和E2治療

實(shí)驗(yàn)分兩步進(jìn)行。首先，21只大鼠被隨機(jī)分配到三組：Sham組、OVX組和OVX-E2組(每組n=7)。在戊巴比妥鈉(60毫克/千克)麻醉下進(jìn)行雙側(cè)卵巢切除術(shù)。假手術(shù)也在戊巴比妥鈉麻醉下進(jìn)行。給切除卵巢的大鼠皮下注射E2 30μg/kg/d(OVX-E2組)或等體積的芝麻油作為藥物對(duì)照(OVX組)。假大鼠在發(fā)情期被殺死。測(cè)量大鼠體重和子宮重量。收集血清以測(cè)定E2水平。收集左心室壁進(jìn)行活檢，并將其保存在-80℃溫度下，以便隨后測(cè)定RNA和蛋白質(zhì)。為了進(jìn)行免疫組化分析，將心肌組織置于10%磷酸鹽緩沖福爾馬林中。其次，將另外21只大鼠隨機(jī)分配到上述三組(每組n=7)。收集心肌組織以測(cè)定H2S生成率、氧化狀態(tài)和促炎細(xì)胞因子水平。

激素測(cè)定

E2使用市售的放射免疫測(cè)定試劑盒進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定內(nèi)和測(cè)定間的平均變異系數(shù)分別為5.78%和6.96%。

免疫組織化學(xué)

心肌CSE免疫組化分析方法如前所述。簡(jiǎn)而言之，制備石蠟包埋切片(5μm)，重新水化，并在檸檬酸緩沖液中微波處理以提取抗原。用3%H2O2淬滅內(nèi)源性過氧化物酶。切片與大鼠CSE抗體(1：100)在4℃孵育過夜。CSE抗體針對(duì)的是與人源CSEC端胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域相匹配的多肽。以3,5-二氨基聯(lián)苯胺為顯色劑，用生物素-鏈霉親和素-過氧化物酶系統(tǒng)(UltraSensitive-SP試劑盒)檢測(cè)結(jié)合情況。陰性對(duì)照時(shí)，用10倍過量的阻斷肽sc-131905P預(yù)吸附一抗。

細(xì)胞因子水平的測(cè)量

將心肌(100毫克)在1毫升磷酸鹽緩沖生理鹽水中均質(zhì)化，該生理鹽水中含有2毫摩爾苯甲基磺酰氟和1μg/ml的安替比林、利普汀和抑肽酶A。勻漿在1,000g轉(zhuǎn)速下離心10分鐘。上清液經(jīng)0.45μm無菌濾器過濾后，在-80℃下保存，直至用于使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒測(cè)定TNF-α和IL-6。TNF-α和IL-6的平均測(cè)定內(nèi)變異系數(shù)分別為2.1%和4.5%。TNF-α和IL-6的平均測(cè)定間變異系數(shù)分別為8.8%和7.0%。

總RNA提取和定量實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

總RNA提取和定量實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄(RT)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的方法如前所述。簡(jiǎn)言之，使用TRIzol試劑制備總RNA。使用M-MLVRT，用寡聚(dT)引物反轉(zhuǎn)錄兩微克RNA。在進(jìn)行PCR分析之前，將得到的互補(bǔ)DNA儲(chǔ)存在-20℃溫度下。CSE(NM_017074)的引物為5'-CGGAGCAATGGAGTTCGC-3'(正向)和5'-GATGGGTAATCGTTGTGGTG-3'(反向)。使用MyiQ Single-Color實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR系統(tǒng)重復(fù)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析。反應(yīng)溶液由40ng的互補(bǔ)DNA產(chǎn)物、0.1μM配對(duì)引物和1×PCR Master Mix組成。檢測(cè)染料為SYBR green。根據(jù)初步實(shí)驗(yàn)對(duì)條件進(jìn)行了優(yōu)化，以確保RNA濃度與PCR產(chǎn)物之間的線性關(guān)系。退火溫度為58℃。擴(kuò)增以40個(gè)循環(huán)進(jìn)行。檢測(cè)PCR產(chǎn)物熔化溫度的溫度范圍設(shè)定為60℃至95℃。通過熔解曲線分析和實(shí)時(shí)RT-PCR產(chǎn)物測(cè)序驗(yàn)證引物特異性。β-Actin用作內(nèi)對(duì)照，用于樣品的加載和歸一化。用算術(shù)公式(2-ΔΔCt)比較Ct(閾值周期)法確定CSE信使RNA(mRNA)的相對(duì)量。

Western blot分析

蛋白質(zhì)提取和Western blot分析方法如前所述。簡(jiǎn)而言之，組織樣本在冷的T-Per裂解緩沖液中均質(zhì)化。裂解液在冰浴中快速超聲，在95℃下煮沸5分鐘，并在-80℃下保存直至使用。樣品(50μg蛋白質(zhì))經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺電泳分離后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。在室溫下，用含0.1%吐溫-20和5%干奶(重量/體積)的三羥甲基氨基丙烷緩沖鹽水將膜阻斷2小時(shí)。用CSE抗體(1：1,000)或3-磷酸甘油醛脫氫酶抗體在4℃下孵育膜過夜。用含0.1%吐溫-20的三相緩沖鹽水沖洗后，用辣根過氧化物酶結(jié)合的二級(jí)IgG(1：1,000)在室溫下孵育膜1小時(shí)。使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光西部印跡檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)免疫反應(yīng)蛋白進(jìn)行檢測(cè)。用密度計(jì)和GeneSnap及GeneTools軟件分析條帶的強(qiáng)度。結(jié)果以與3磷酸甘油醛磷酸脫氫酶對(duì)照的比率表示。

實(shí)時(shí)測(cè)量H2S量

組織中H2S的實(shí)時(shí)生成量測(cè)量方法如前所述。簡(jiǎn)而言之，將大約100毫克的大鼠心臟組織在含有蛋白酶抑制劑(2毫摩爾苯甲基磺酰氟、1毫摩爾正釩酸鈉和10毫克/毫升杏仁蛋白)的冷磷酸鹽緩沖鹽水(5毫升)中剁成小顆粒，洗滌三次，勻漿15秒。在5,000rpm轉(zhuǎn)速下離心5分鐘后，將上清液放入溫控微呼吸室(Unisense)，使用微型H2S微呼吸電極(型號(hào)H2S MRCh；Unisense)和Unisense PA2000放大器測(cè)量實(shí)時(shí)H2S產(chǎn)量。使用改良的布拉德福德測(cè)定法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

還原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽含量、總抗氧化能力以及SOD和過氧化氫酶活性的測(cè)定

用冷生理鹽水勻漿心肌(100毫克)。勻漿在1,000g轉(zhuǎn)速下離心10分鐘。還原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)比值、總抗氧化能力(T-AOC)、SOD和過氧化氫酶(CAT)活性的測(cè)定采用Winching公司的試劑盒。GSH/GSSG、T-AOC、SOD和CAT的平均測(cè)定內(nèi)變異系數(shù)分別為2.8%、3.2%、1.7%和1.9%。GSH/GSSG、T-AOC、SOD和CAT的平均測(cè)定間變異系數(shù)分別為5.32%、6.83%、3.52%和4.94%。