摘要

背景：在與人類相關(guān)的微生物群落中，微生物反硝化作用被認(rèn)為并不重要。因此，對人類牙菌斑微生物生物膜群落的新陳代謝研究主要集中在有氧呼吸和碳水化合物的酸發(fā)酵上，盡管人們知道口腔棲息地經(jīng)常暴露在毫摩爾濃度的硝酸鹽(NO3-)中，而且牙菌斑中的細(xì)菌可以將NO3-還原成亞硝酸鹽(NO2-)。

結(jié)果：我們利用微電極測量、15N同位素標(biāo)記和反硝化基因的分子檢測表明，牙菌斑介導(dǎo)了一氧化氮(NO)、一氧化二氮(N2O)和氮?dú)?N2)的反硝化作用。口腔中N2O的體內(nèi)積累率取決于牙菌斑的存在和唾液中NO3-的濃度。在有氧條件下，通過反硝化作用產(chǎn)生NO和N2O，并受牙菌斑pH值的調(diào)節(jié)。

總結(jié)：NO濃度的增加處于向人類宿主細(xì)胞傳遞NO信號的有效濃度范圍內(nèi)，因此可能對局部血流、神經(jīng)之間的信號傳遞以及牙齦的炎癥過程產(chǎn)生影響。這對了解牙周疾病具有特別重要的意義，因?yàn)镹O在牙周疾病中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，但牙齦細(xì)胞被認(rèn)為是NO的唯一來源。更廣泛地說，這項(xiàng)研究將人類相關(guān)微生物群落的反硝化作用確定為一個(gè)重要的代謝途徑，由于同時(shí)形成了NO，為共生互動提供了基礎(chǔ)。

背景

人體中自然存在著各種各樣的微生物，它們的新陳代謝活動對人體生理和健康非常重要。對這些復(fù)雜群落的功能潛力和控制進(jìn)行評估的大多數(shù)研究都依賴于：(i)單個(gè)分離物或富集物的特征描述，(ii)對被認(rèn)為介導(dǎo)特定過程的微生物進(jìn)行量化，或(iii)對特定身體區(qū)域進(jìn)行元基因組分析。微生物生態(tài)學(xué)的既定方法允許在不同的實(shí)驗(yàn)條件下直接測量人體天然微生物樣本的新陳代謝轉(zhuǎn)換，如同位素標(biāo)記底物的培養(yǎng)、特定化合物的染料探針與顯微鏡或電化學(xué)微傳感器的結(jié)合，但這些方法鮮有報(bào)道。不過，有人提出人類體內(nèi)存在不同的微生物途徑，包括發(fā)酵、硫酸鹽還原、甲烷生成和乙酰生成。令人驚訝的是，反硝化作用(硝酸鹽(NO3-)或亞硝酸鹽(NO2-)通過NO呼吸還原為N2O或N2被認(rèn)為在與人類相關(guān)的微生物群落中微不足道，盡管NO3-和NO2-在人的口腔等身體各部位與微生物共同存在，且濃度很高。

反硝化作用由兼性厭氧微生物進(jìn)行，與還原有機(jī)碳或還原無機(jī)化合物(如亞鐵、硫化氫或氫)的氧化作用結(jié)合在一起。反硝化作用的還原順序(NO3->NO2->NO>N2O>N2)由每一步的特異性周質(zhì)酶和膜結(jié)合酶介導(dǎo)。在復(fù)雜的微生物樣本中檢測反硝化作用最重要的基因是：narG(NO3-還原酶)、nirS和nirK(NO2-還原酶)、qnorB或cnorB(NO還原酶)和nosZ(N2O還原酶)。反硝化細(xì)菌在純培養(yǎng)物和復(fù)雜的微生物群落(如土壤、氮循環(huán)生物膜和不同無脊椎動物腸道內(nèi)攝入的細(xì)菌)的代謝活動中釋放NO或N2O作為中間產(chǎn)物。

值得注意的是，人類唾液中的NO3-濃度在毫摩爾范圍內(nèi)，因?yàn)樯攀持械腘O3-從腸道吸收進(jìn)入血液后，會集中在唾液腺中。因此，牙菌斑中與人類相關(guān)的微生物生物膜群落以及覆蓋在口腔表面其他的細(xì)菌都暴露在NO3-中。然而，對牙菌斑新陳代謝的研究主要集中在有氧呼吸和碳水化合物的酸發(fā)酵上。對大鼠舌頭以及人類口腔中的牙齒和其他表面進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明，唾液中的NO3-可被口腔微生物轉(zhuǎn)化為NO2-，這就解釋了唾液中除了NO3-之外還存在NO2-的原因。在人的口腔中培養(yǎng)的空氣中檢測到NO，這導(dǎo)致了一種假設(shè)，即細(xì)菌衍生的唾液NO2-在口腔酸性微環(huán)境中化學(xué)還原為NO。由于無法在牙科生物膜中測量相關(guān)空間尺度的NO，因此其基本過程從未被直接證明。因此，其他研究者認(rèn)為人類唾液中的NO2-是由牙齦細(xì)胞合成的NO的穩(wěn)定氧化產(chǎn)物，用于調(diào)節(jié)牙齦免疫和血管系統(tǒng)。

由于可能形成NO，牙菌斑的氮代謝可能對牙齒健康很重要。牙菌斑會導(dǎo)致牙周病和齲齒，幾乎影響到每一個(gè)人。牙周病是牙齒周圍牙齦組織的一種炎癥性疾病，如果在牙齦-牙菌斑界面產(chǎn)生的副產(chǎn)品是NO，那么牙菌斑的氮代謝可能會對牙周病產(chǎn)生特別大的影響。NO在牙周病中發(fā)揮著復(fù)雜的作用，但人們對它的了解并不多。低濃度的NO是一種重要的信號分子，可協(xié)調(diào)參與炎癥過程的免疫系統(tǒng)細(xì)胞的功能。細(xì)菌脂多糖會刺激促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而誘導(dǎo)某些免疫系統(tǒng)細(xì)胞產(chǎn)生高濃度且具有細(xì)胞毒性的NO。此外，炎癥期間高濃度的NO會誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶，從而介導(dǎo)軟組織降解。

除了對牙齒健康的潛在重要性，口腔氮代謝對人體生理也很重要。口腔微生物形成的NO2-作為反硝化中間體導(dǎo)致NO2-在酸性胃中化學(xué)轉(zhuǎn)化為NO，作為抗菌劑對抗病原菌并刺激胃血流。此外，NO2-被吸收到血漿中，成為缺氧條件下調(diào)節(jié)血管舒張的NO來源。目前還不清楚與口腔表面其他相比，人類牙菌斑中的微生物氮代謝是否重要。

在本研究中，我們假設(shè)牙菌斑是人類微生物反硝化的棲息地，推動唾液中的NO3-向反硝化中間產(chǎn)物NO和N2O以及最終產(chǎn)物N2的生物轉(zhuǎn)化。我們直接使用微生物生態(tài)學(xué)方法，包括最近開發(fā)的NO微電極，來證明牙菌斑中反硝化過程中NO的原位形成，并證明NO的形成濃度對宿主組織的信號傳遞具有重要意義。此外，我們還希望通過將人類口腔中N2O的積累與唾液中NO3-/NO2-的濃度以及牙菌斑的存在相關(guān)聯(lián)，來證明牙菌斑反硝化對形成反硝化中間產(chǎn)物的重要意義。