方法

樣本采集

用牙簽或牙線從未用過抗生素、未被診斷患有牙周炎和/或其他嚴重疾病的男女志愿者(25至52歲)身上采集天然牙菌斑樣本。

從同位素標記的NO3-中產生N2

用牙簽從三名志愿者的牙齒表面和近端(IP)間隙收集牙齒生物膜，并在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS；pH7.2)中清洗兩次。樣本中的蛋白質含量按照Lowry的方法測定。生物膜經渦旋勻漿后，將每個個體的材料平均分配到三個外容器(3.8毫升)中，并注入空氣飽和培養基(磷酸鹽緩沖鹽水和2%蔗糖)。加入50μM Na15NO3后立即開始培養，并在37溫度下持續攪拌。在三個時間點(t0=0小時；t1=3.5小時；t2=5小時)加入最終濃度為0.5%的氯化鋅停止生物反應之前，直接用O2微電極測量溶解氧濃度。將2毫升氦氣頂空引入封閉的外容器并在液相和氣相之間進行平衡后，使用四極桿質譜儀測量30N2。

微電極測量

兩名志愿者的牙菌斑在口腔外用NO、N2O、O2、pH和NO3-微電極進行了原位測量。將整塊生物膜放在固體瓊脂(1.5%)上，用一滴熔融瓊脂(0.5%)固定，然后覆蓋在無緩沖蔗糖/鹽培養基(68mM NaCl、8mM MgCl2、3.6mM CaCl2、26.8mM KCl、2%蔗糖；pH6.6至7.2)上。測量前生物膜至少平衡20分鐘，測量在生物膜回收后6-8小時內進行。NO、N2O和O2以及離子選擇性pH和NO3-微電極的制造和微傳感器的測量按照之前的描述進行。在添加760μM NaNO3之前和之后測量穩態微檔案，同時在介質表面噴射空氣，在生物膜上方形成恒定的流動機制。為了研究生物膜中pH值為6至7的氮循環，培養基中添加了磷酸鹽緩沖液(10mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4，pH值為7.2；類似于1×PBS中的濃度)，從而排除了NO2-的化學還原。為了提高傳感器的性能，在含鹽量較低的培養基中，以及在存在和不存在50μM NaNO3(而不是760μM)的情況下測量了NO3-微譜分析。所有測量都是在同一個生物膜點進行的。因此，這些測量結果適用于得出機理結論。不過，這些數據沒有考慮生物膜的異質性，不適合計算特定生物膜表面的平均通量。我們用第二個個體的生物膜重復了相同的實驗，結果顯示了相同的處理效果。

牙科生物膜中脫氮基因的分子分析

五名志愿者在12小時內未刷牙或進食，用無菌牙簽從牙齒表面和IP間隙收集牙菌斑，按照牙菌斑優化方案提取DNA。反硝化基因narG、nirS、nirK、cnorB、qnorB和nosZ部分序列的PCR擴增在總體積為20μl的10×PCR緩沖液中進行，緩沖液中含有2μl 10×PCR緩沖液、250μM三磷酸脫氧核苷、1U Taq聚合酶、0.3mg/ml牛血清白蛋白(BSA)、每種引物0.5μM和10至100ng DNA。所使用的引物針對不同生物的多種反硝化基因，PCR實驗按照相應方案中的描述進行，并做了一些修改。擴增子在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳分析，然后進行溴化乙錠染色。對22個擴增子中11個具有預期大小的擴增子構建了克隆文庫并進行了測序，以確認PCR產物與目標基因相對應。使用QIAQuick PCR純化試劑盒純化擴增子，并按照制造商的說明使用TOPO TA克隆系統進行克隆。獲得的序列通過BLAST http://www.ncbi.nlm.nih.gov進行分析。11個克隆文庫中只有1個不含目標基因(nirS，研究對象D)。

口腔空氣中的N2O積累

共有15名志愿者(25至52歲)被要求在測量前一天晚上和早上不刷牙。他們可以進食和飲水，但在測量前的最后一小時內不得進食和飲水。為了只測量口腔中產生的N2O，而不測量肺或胃中產生的N2O，我們向空口注入環境空氣(30毫升)。隨后，我們要求志愿者用鼻子呼吸，同時將嘴與鼻咽部隔開，并將注入的空氣留在口中。我們將這種空氣定義為口腔空氣，其中積聚了口腔產生的N2O。分別在30秒和90秒后通過注射器的鈍頭抽取兩份氣體樣本(1毫升)，并將其注入氣密性外容器(3毫升)中。志愿者在未刷牙和刷牙的情況下重復此采樣方案各五次。此外，還按照包裝上的說明，測量了7名志愿者在刷牙和使用含洗必泰的消毒漱口水1分鐘后的N2O累積率。刷牙前，志愿者收集1毫升唾液，并立即冷凍，以備日后分析NO3-/NO2-的濃度。使用配備63Ni電子捕獲檢測器的氣相色譜儀分析口腔空氣中的N2O濃度。根據30秒到90秒之間的濃度差和培養空氣量，計算出N2O的積累率(單位：nmol/個體/小時)。在其他試驗中，口腔空氣中N2O濃度的增加至少在240秒內是線性的。

在另一項實驗中，四名未刷牙的志愿者在飲用200毫升含有12毫摩爾NO3-的甜菜根汁之前和之后2小時測定了N2O的積累率。志愿者在飲用甜菜根汁之前和之后每小時采集0.5毫升唾液，用于隨后的NO3-/NO2-濃度分析。一般在飲用甜菜根汁2小時后測量唾液中NO3-和NO2-的最高濃度。唾液樣本經離心清除后，用VCl3還原法分析NO3-/NO2-濃度，然后用化學發光檢測器測量NO。