結果

牙菌斑介導有氧反硝化作用

圖1、牙菌斑中的反硝化作用。將三個人的牙菌斑懸浮在含有2%蔗糖和50μM Na15NO3的pH值為7.2的有氧礦物緩沖培養基中。在時間序列實驗中測量了(a)30N2(單位：μM/mg蛋白質)和(b)表觀O2濃度(單位：μM)的形成。每個符號類型代表一個人牙菌斑培養的30N2和O2測量值。對照組是在沒有Na15NO3的情況下進行的。

牙菌斑通過反硝化作用將NO3-轉化為N2。在培養分散的牙菌斑過程中，15NO3-生成30N2就證明了這一點(圖1a)。

表1、五名志愿者牙齒生物膜中的反硝化基因。

通過聚合酶鏈式反應(PCR)檢測將NO3-還原成N2所需的所有基因(NO3-還原酶、NO2-還原酶、NO還原酶、N2O還原酶)，證實了牙科生物膜中存在完全的反硝化作用(表1)。呼吸作用NO還原酶的基因僅限于存在依賴喹啉型(qnorB)，而不存在依賴細胞色素c型(cnorB)。

有兩個證據表明，牙科生物膜中的反硝化作用是在有氧條件下發生的。首先，我們觀察到懸浮在添加了50μM 15NO3-的空氣飽和培養基中的牙菌斑產生了30N2(圖1a)。該培養基中的氧氣測量結果表明，有氧異養呼吸不會導致培養期間出現缺氧情況(圖1b)。

圖2、原位檢測口腔外牙科生物膜的代謝活動和微環境條件。微電極測量牙菌斑中NO3-、O2、NO、N2O和pH的濃度曲線。培養基中含有非緩沖礦物混合物和2%的蔗糖。a-d顯示的是上層培養基中50μM NaNO3(紅色)的測量結果。e-h顯示了在無NaNO3(黑色)和有760μM NaNO3(紅色和綠色)時的測量結果。綠色符號顯示的是在磷酸鹽緩沖鹽水(pH7.2)和760μM NaNO3存在的情況下進行的測量。水平線代表生物膜表面。測量是在同一樣本點進行的，因此具有直接可比性。

其次，微電極測量顯示，在有O2存在的情況下，NO3-被消耗，并且在有O2存在的情況下，還形成了反硝化中間產物NO和N2O(圖2a-d)。在如此低的NO3-濃度下，可以想象所有的NO3-都被用于同化成生物質，因此無法用于呼吸脫氮。然而，在該斑塊樣本中，當NO3-濃度為50μM時，NO3-并未被完全消耗(即NO3-并非限制性的)(圖2a)。因此，在50μMNO3-濃度下，NO3-同化和反硝化作用肯定已經達到最大能力。將NO3-濃度進一步提高到760μM很可能不會改變這兩種途徑對NO3-總吸收量的貢獻。反過來，生物膜在760μM的NO3-濃度下仍保持缺氧狀態，并產生反硝化中間產物NO和N2O(圖2f-h)，這表明在高濃度NO3-下，有氧反硝化也很活躍。

斑塊脫硝過程中化學和生物NO和N2O的形成與pH值有關

圖3、通過酸性分解NO2-形成NO。在不同pH值的磷酸鹽緩沖鹽溶液中滴定不斷增加的NO2-濃度時，使用NO微電極測量NO的形成。

NO3-是牙科生物膜中NO和N2O的來源。NO和N2O的形成僅限于NO3-的存在(圖2g，h)。牙科生物膜中NO的形成是由生物NO2-還原和NO2-的酸性分解介導的。在非緩沖培養基中，細菌活性降低，生物膜pH<5(圖2e)，深度平均NO濃度從0.08μM增加到0.15μM(圖2g)。在pH值為4.7的緩沖液中滴定50μM的NO2-，結果表明NO2-的酸性分解會導致約0.05μM NO的化學形成(圖3)，這與在pH值小于5的生物膜中觀察到的增加處于同一范圍。NO2-也能在唾液中自然積累到50μM或更高的濃度。綜上所述，這表明在牙菌斑pH值較低時，NO2-的酸性分解有助于NO的形成，而生物NO的形成仍可能同時發生。

從反硝化代謝平衡的角度來看，酸性條件導致的NO絕對增加量很小。這一點很明顯，因為在酸性條件下，N2O(NO的還原產物)的深度平均增加量比NO濃度的增加量高出約兩個數量級。這表明生物膜細菌能有效地將大部分NO轉化為N2O，從而將細胞毒性NO的穩態濃度保持在較低水平，這在環境生物膜中也有觀察到。

NO的形成會減少牙菌斑對O2的吸收

在中性pH下，NO3-存在下的氧氣吸收量高于酸性條件下的氧氣吸收量(圖2e、f)。O2曲線顯示，O2通量減少了50%，即從緩沖條件下的-105nmol/cm2/h降至非緩沖條件下的-43nmol/cm2/h。在沒有NO3-的情況下，僅酸性pH值不會導致氧氣吸收量減少，因為氧氣通量為-143nmol/cm2/h。細菌O2消耗量的減少可能是由于最高NO濃度(0.15至0.2μM)的直接毒性作用造成的，如NO與末端呼吸性O2還原酶的結合。然而，從0.08μM到0.2μM的絕對濃度增加可能不會影響呼吸作用，因為以前的研究表明，0.8μM以上的濃度是抑制大腸桿菌中O2還原所必需的。此外，一小部分電子不僅不會促進O2的還原，反而可能被優先用于通過還原成N2O來解毒NO，從而導致N2O濃度升高和O2吸收受到抑制(圖2f，h)。

人類口腔中N2O的產生取決于唾液中的NO3-和牙菌斑的存在

圖4、(a)15名未刷牙志愿者的口腔N2O生成量與唾液中NO2-/NO3-濃度的相關性。每個數據點代表一個人在某一天的口腔N2O累積率(黑點)。有些志愿者不止一天被采樣，因此總共有19個數據點。四名志愿者在飲用富含NO3的甜菜根汁前后進行了額外采樣，以增加唾液中NO2-/NO3-的濃度和口腔N2O的積累(虛線連接的白圈)。(b)口腔衛生對口腔N2O積累率的影響。刷牙前個人的口腔N2O積累率與刷牙后的N2O積累率對比圖(黑點)。六個人在刷牙后使用了可影響整個口腔細菌的殺菌漱口水(圓圈，六個人各用一種顏色表示)。例如，一個人(深綠色)的口腔一氧化二氮累積率為500nmol/h，刷牙后，其累積率降至290nmol/h。隨后使用漱口水的結果是110nmol/h。虛線表示口腔衛生對口腔N2O積累沒有影響。誤差條表示五次重復測量口腔N2O積累率的標準誤差。

我們培養了人類口腔中的空氣("口腔空氣")，并測量了N2O的積累率，以量化口腔生境中脫氮的活體意義。將口腔空氣中的N2O積累與牙齒生物膜的存在和唾液中的NO3-/NO2--濃度聯系起來(圖4)。在有牙菌斑的情況下，不同受試者的N2O積累量差異很大，從11到443nmol/h。不同受試者的N2O積累量隨著唾液中NO3-/NO2-濃度的增加而增加(圖4a)。飲用200毫升含有12毫摩爾/升NO3-的甜菜根汁會增加唾液中NO3-/NO2-的濃度，從而導致口腔N2O積累速度增加3.8到9.1倍。

牙齒生物膜是人類口腔中產生N2O的主要場所。這一點很明顯，因為在普通刷牙的同時使用殺菌漱口水可使口腔N2O的累積率降低82%，而單獨刷牙可使口腔N2O的累積率降低62%(圖4b)。