討論

我們的數據明確顯示，反硝化作用是與人類相關的微生物群落中的一個相關過程。迄今為止，人們一直認為人類體內的NO完全還原過程僅限于硝酸鹽還原成氨(DNRA)的異纖化過程，因為從人類體內分離出的大多數細菌都能進行這一反應。眾所周知，DNRA是一種嚴格的厭氧過程，在厭氧還原環境中比反硝化作用更受歡迎。因此，在人體腸道的還原性厭氧環境中，二硝化還原反應可能占主導地位，而在氧化程度較高的牙菌斑中則存在反硝化作用。反過來，可以想象DNRA存在于不易被清除的牙菌斑中，因此，牙菌斑一直處于缺氧狀態，而且還原程度較高。從理論上講，在這種生物膜中，NO2-的還原可能與氨的厭氧氧化(anammox)結合在一起(圖5，黑色虛線)，特別是如果宿主組織或二硝基氧化還原酶的蛋白質降解可以提供氨的來源，正如在海洋開放水域棲息地所報道的那樣。不過，在細菌和NO3-共存的其他氧化環境中，也可能存在反硝化作用。例如，除唾液外，NO3-還存在于其他體液中，這些體液可能提供了一個相當氧化的環境(例如，血液中的NO3-為20-40μM，尿液中的NO3-約為500μM)。因此，反硝化作用可能與其他疾病或健康部位的微生物生物膜有關，如囊性纖維化肺、中耳炎耳朵、植入物、導管和陰道粘膜等。

圖5、人類牙菌斑中唾液NO3-的微生物轉化及其可能的后果。灰色線條表示以前報道過的途徑。虛線表示本研究或其他研究中尚未報道的牙菌斑中可能存在的途徑。彩色線條表示本研究認為可能存在的途徑。綠線表示生物介導的途徑，紅線表示化學或物理介導的途徑。如果通過聚合酶鏈反應(PCR)在牙科生物膜中檢測到了介導反硝化各個步驟的酶的編碼基因，則將其描繪出來。未檢測到依賴細胞色素c的NO還原酶(cNorB)的基因。Anammox=氨的厭氧氧化；DNRA=將硝酸鹽還原為氨。

反硝化和DNRA在最終產物、代謝控制和釋放的中間產物方面存在本質區別，因此對宿主的生理機能產生不同的影響。銨是DNRA的最終產物，宿主細胞和相關微生物可將其作為一種固定氮形式利用。此外，人體內的DNRA可能會使銨積累到有害濃度。相比之下，反硝化作用的最終產物N2是宿主固定氮的損失，不會影響人體細胞。此外，微生物反硝化作用產生的信號分子NO可能會影響宿主細胞與其相關微生物群落之間的相互作用。

有趣的是，牙齒生物膜中的反硝化作用是在有氧條件下發生的。這表明牙菌斑并不一定要在缺氧的微環境中才能發生反硝化作用。分離的細菌菌株和微生物群落偶爾也能在有氧氣的情況下進行反硝化。在富含NO3-的生境中，有氧反硝化可確保穩定的電子接受過程，該過程暴露于O2濃度的頻繁波動中，無需新酶系統的能量需求表達。這可能完全適用于口腔棲息地，因為口腔中唾液NO3-濃度高，O2濃度也可能波動。

盡管牙科生物膜中的微生物種類繁多，但我們只能檢測到依賴喹啉型(qnorB)的呼吸型NO還原酶基因，而不能檢測到依賴細胞色素c型(cnorB)的呼吸型NO還原酶基因。有趣的是，在非反硝化病原菌中也發現了編碼qNorB的基因，在這些病原菌中，qNorB參與NO解毒，而不是呼吸電子傳遞。顯然，在調查的牙科生物膜中，呼吸性NO還原完全由qNorB介導。此外，qNorB還可以作為一種保護酶，抵御來自宿主細胞、NO2-酸性分解物和其他生物膜細菌的有毒NO。

我們的研究結果為牙菌斑中的氮轉化建立了一個機理模型(圖5)。首先，唾液中的NO3-還原形成NO2-，然后進一步反硝化形成中間產物NO和N2O，最后形成N2(圖5，綠線)。除了生物轉化步驟外，該機理模型還包括一個由pH值控制的從NO2-到NO的化學轉化步驟(圖5，紅線)。如果酸性發酵使牙菌斑的pH值小于5，就會發生從NO2-到NO的化學轉化。在酸性條件下，NO的高周轉率會導致牙科生物膜對氧氣的吸收減少。這表明牙菌斑中不同微生物活動的代謝耦合是由NO介導的。此外，細菌對作為信號分子的NO也有反應。具體來說，NO參與了細菌從生物膜中的擴散。綜上所述，NO可能是平衡天然牙菌斑群落發展的細菌衍生因子。因此，從"生態牙菌斑假說"的角度來看，NO可能是一個重要的因素。"生態牙菌斑假說"認為，口腔中的環境因素(例如pH值和唾液中的NO3-)決定了牙菌斑微生物群落是以維持健康的微生物為主，還是以致病微生物為主。

人體細胞可通過NO合酶活性從精氨酸中產生NO，并對其他細胞產生的NO信號分子做出反應。在牙齦組織中，NO參與血壓調節和炎癥過程，如牙周疾病。在酸性條件下，牙菌斑中的深度平均NO濃度從0.08μM增加到0.15μM(圖2g)，處于生理有效范圍內，可用于調節局部血壓、神經信號轉導事件以及調節牙菌斑附近組織的免疫系統。因此，我們假設pH值波動和牙菌斑脫氮可通過調節NO的濃度(圖5，綠線)對牙齦局部的血流、神經之間的信號傳遞和炎癥過程產生影響。NO介導的相互作用在致齲斑塊與牙周斑塊中有所不同，因為兩者的pH值不同。致齲菌斑中的低pH值可能會誘導化學NO的形成，從而導致高濃度的NO，而牙周菌斑中NO的形成僅限于微生物過程，因為其pH值大于7。如上所述，微生物反硝化作用可能與人體其他健康和患病部位有關。因此，從更廣泛的意義上講，微生物反硝化作用可被視為人體形成NO的另一種途徑，并為人體相關微生物與鄰近宿主細胞之間的共生互動提供了基礎。

牙菌斑的存在導致口腔空氣中作為反硝化中間產物的N2O的積累，這取決于唾液中NO3-的濃度。這表明反硝化作用是在體內進行的，而飲食中NO3-的攝入會影響牙菌斑的反硝化作用。15名未刷牙且唾液中NO3-/NO2-濃度未受操控的志愿者的口腔N2O排放平均速率為80nmol/h。雖然早先對人類呼吸空氣進行的調查顯示N2O濃度高于環境大氣水平，但我們的研究首次提出了這種溫室氣體的口腔相關排放率。根據我們的數據推斷，以目前全球67億人口計算，人類口腔相關的N2O排放量為0.00013TgN/a，占每年向大氣排放的N2O總量16.4TgN/a的0.0008%，微不足道。

牙齒生物膜是人類口腔中產生N2O的主要場所。這一結果和微傳感器數據有力地表明，牙菌斑也是口腔中形成其他反硝化中間產物NO2-和NO的主要場所。因此，唾液中NO2-的測量結果并不能充分代表口腔中人類宿主細胞形成NO的情況(圖5)。此外，在使用呼氣和唾液中的NO和NO2-測量值診斷全身性疾病(如腎衰竭和囊性纖維化)時，需要考慮牙菌斑的反硝化作用。一般來說，與其他口腔表面相比，牙菌斑對反硝化中間產物的形成非常重要，這表明牙菌斑細菌與口腔表面的其他細菌一樣對口腔氮轉化非常重要。因此，牙齒生物膜和唾液中的NO3-濃度在調節體內NO2-濃度中起著至關重要的作用，并影響人體中與NO2-相關的生理功能，如缺氧性血管舒張和酸性胃中的抗菌活性(圖5，灰線)。

許多解剖部位，包括皮膚、口腔、胃、結腸和陰道，都居住著不同的微生物群落，這些群落具有多樣性的特點。這表明，由微生物介導的不同代謝途徑具有影響人體生理的多功能潛力。然而，與人類相關的復雜微生物群落的活動或功能潛力卻很少得到研究。因此，我們預計，如果將與人類相關的微生物群落的研究擴展到碳、硫、鐵等元素的循環，利用測量微生物群落原位活動的技術，將能發現微生物與人類之間意想不到的功能和相互作用。可用于這些實驗的微生物生態學工具箱包括各種技術，如微電極、同位素或放射性標記，可在大量培養基和單細胞水平上進行檢測，所有這些技術都可與系統發育鑒定相結合。這種生態生理學方法可以直接檢驗在人類微生物組項目背景下產生的元基因組數據中提出的假設。

總結

人類牙菌斑在唾液NO3-的基礎上介導反硝化作用。牙菌斑的反硝化作用是在有氧條件下進行的，并以pH值依賴的方式導致生物和化學NO和N2O的形成。牙菌斑對O2的吸收受到NO的抑制。因此，NO的形成介導了菌斑細菌之間的新陳代謝相互作用。此外，NO產生的濃度水平允許向人類宿主細胞發出信號，這表明它在牙齦組織炎癥性疾病(即牙周病)的調節中起著重要作用。除了NO合成酶活性和二氧化氮的酸性分解外，微生物反硝化作用也是人類形成NO的另一種途徑。牙菌斑中的反硝化作用是人類口腔氮循環中間產物產生的相關場所，并且依賴于唾液中的NO3-。因此，用于檢測全身性疾病的呼氣分析應考慮牙菌斑的活性，牙菌斑中的反硝化作用可能會影響整個人體的生理機能。