材料與方法：

實驗程序：

組織恢復方法獲得了新西蘭懷卡托大學動物倫理委員會的批準。

藻類培養：

衣藻（野生型1690）在250mL的棉塞Duran玻璃瓶中用100mL磷酸三乙酸酯（TAP）培養基培養7-10天，接種自在含瓊脂15g/L的滅菌固體TAP培養基上培養的菌落。液體培養基建立后，每周用100毫升TAP培養基補充10毫升藻類懸浮液。培養條件為室溫（20.5±0.5°C），使用磁力攪拌器（250rpm）或通氣（300mL/min）持續攪拌。恒定光源位于培養容器上方20厘米處。

氧氣測量：

溶解氧濃度（毫克/升）是使用克拉克型氧電極（尖端直徑25微米）（丹麥Unisense有限公司）測量的，該電極與單通道微傳感器裝置相連，并以5赫茲的速率采樣。每天開始時對電極進行極化，以獲得穩定的輸出。在與室內空氣平衡的溶液和0.1M抗壞血酸鈉（零點）中進行兩點校準。

衣藻培養的氧氣產量：

皮層腦組織在體外人工腦脊液（aCSF）中保存，這種鹽培養基的成分與用于培養衣藻的TAP培養基有很大不同。因此，有必要確認懸浮在人工腦脊液中的藻類培養物是有生命力的，并且能夠產生可能支持大腦皮層新陳代謝的氧氣。

無鎂無碳酸鹽層中的氧氣產生量（n=5）：

將TAP培養基中的藻類懸浮液（30mL）轉移到10mL管中，并通過離心（4,400rpm，8分鐘）將細胞與TAP培養基分離。除去TAP培養基上清液，將細胞重懸于不含鎂離子的30mL室內平衡aCSF中。從無鎂腦脊液中去除鎂離子可支持大腦皮層切片組織的網絡活動的大腦皮層切片實驗。無鎂aCSF由124mM NaCl、5mM KCl、2mM CaCl2、1.25mM NaH2PO4、2.5mM NaHCO3、10mM HEPES和10mM D-葡萄糖組成。LED光源位于樣品上方10厘米處，測量值為燈泡底部到容器中部的垂直距離。樣品處的光強（LUX）測量值為310μmol/m2。在室溫（20.5±0.5?C）條件下，持續光照90分鐘，在培養基表面下約3毫米處測量氧氣含量。定期輕輕攪拌培養物，以防止藻類沉淀。

干重電池質量：

產氧測試結束后，對部分樣本（n=4）的藻類干重（DW）進行量化。將樣品轉移到預先稱重的10毫升試管中，以每分鐘4,400轉的轉速離心15分鐘，直至上清液變清。小心去除上清液，將細胞物質留在試管底部。將試管放入約100?C的對流烘箱中烘干60分鐘。重新稱量試管，得出細胞材料的干重。

皮層切片制備，組織解剖和制備：

皮質切片按照常規方法制備。簡單地說，用二氧化碳麻醉成年雄性或雌性C57小鼠，迅速解剖大腦并將其浸沒在由125mM NaCl、2.5mM KCl、1mM MgCl2、2mM CaCl2、1.25mM NaH2PO4、2.5mM NaHCO3、10mM HEPES和10mM D-葡萄糖組成的冰冷"正常"aCSF中。使用振動切片機將大腦冠狀切成Bregma1至5之間400μm厚的切片。隨后，在室溫（約21?C）下將切片浸入無鎂aCSF中至少60分鐘。所有溶液都通過95%氧氣（氮氣平衡）的"傳統"氣泡充氧。

皮層切片制備，癲癇樣事件(SLE)活動的組織記錄：

組織制備完成后，切片被轉移到灌注記錄槽中，并浸沒在無鎂無碳酸鹽溶液中。將大腦皮層切片暴露在無鎂的無碳酸鹽溶液中，可通過解除對NMDA受體的阻斷來激活組織，從而產生重復的、自發的陣發性事件，即癲癇發作樣事件（SLEs）。所有皮層和區域均可記錄SLE，它反映了興奮性和抑制性神經元混合群的協調發射。SLE參數可用作組織代謝狀態和存活率的指南，本研究利用這些參數來確定藻類培養物是否能支持無血管皮層組織中的能量網絡活動。特別是，SLEs數量（頻率）和大小（振幅和長度）的減少反映了組織受到新陳代謝的挑戰。

皮層系統性紅斑狼瘡活動是通過一個75微米的Ag/AgCl電極在細胞外記錄的。在記錄槽中與切片相距較遠的一個圓盤銀/氯化銀電極被用作共同參考/接地。模擬信號被放大1000倍，并轉換成數字信號，用于后期分析。模擬信號經過以下濾波：高通∥1Hz，低通∥300Hz，陷波濾波器為50Hz，采樣率為1000s∥1。

皮層切片實驗方案1：急性（30分鐘）海藻暴露：

這組實驗的目的是確定在以光合作用為唯一氧氣補充來源的藻類環境中，大腦皮層網絡動態是否能夠得到支持。

將皮層切片轉移到浸沒式灌注浴中。在灌注（5mL/min）無鎂aCSF的同時，在每個切片的單個皮層位置建立系統性紅斑狼瘡活動基線，該aCSF通過氣泡式95%氧氣和平衡氮進行常規充氧。灌注是通過重力從位于灌注浴上方60厘米處的貯水池中輸入的。在建立穩定的基線SLE活性后，對無鎂aCSF（如上所述制備）中的藻類懸浮液灌注約30分鐘（n=9）。灌注浴用10WLED燈點亮，LED燈略微傾斜，高出灌注浴10厘米。升高的培養槽用一個14W的LED燈點亮，該LED燈位于培養槽容器上方10厘米處。培養液未進行外部充氧。然后用未充氧（室內平衡）的無鎂aCSF向浴槽灌注約20分鐘，然后再回到常規充氧的無鎂aCSF。有三次，每次灌注一個切片；有兩次，同時灌注三個切片，每個切片只有一個記錄位置。在一次試驗中，藻類培養液換成了灌注的含氧無鎂腦脊液，并完全重復了無氧無鎂腦脊液的試驗方案（使用相同的切片和記錄位置）。

在另一組實驗中（n=6），切片在基線記錄后暴露于"脫氧"的無鎂aCSF中。為了使氧氣濃度低于未缺氧的室溫平衡aCSF，在加入aCSF鹽之前，先將蒸餾水煮沸4-5分鐘，然后將其置于無空氣的密閉容器中，冷卻至室溫（使aCSF的氧氣水平達到1-2mg/L）。

這些方案提供了四種腦脊液充氧條件，用于比較對系統性紅斑狼瘡活動的影響：常規充氧（用95%的氧氣鼓泡）；光合藻類充氧；不充氧（室內平衡）和脫氧。假設沒有急性毒性，我們的假設是，在暴露于藻類期間，大腦皮層的動態將保持不變，但當室內平衡和脫氧aCSF中的氧含量降低時，大腦皮層的動態將受到明顯抑制。

作為對照，將切片（n=6）暴露于未吸氧的aCSF中，同時照亮或不照亮aCSF儲庫和切片灌注浴。

皮層切片實驗方案2：組織和aCSF氧合：

這組實驗的目的是量化不同充氧條件下腦脊液和大腦皮層組織中的氧含量：常規充氧（n=12）；光合藻類充氧（n=7）；無充氧（n=12）。

由于浸沒皮層切片實驗中的氧濃度隨aCSF深度變化很大，因此要生成從aCSF表面到切片中部的氧曲線。根據上述實驗條件將皮層切片置于灌注浴中，使用精密微型機械手電極以150微米的步長前進，直到尖端停留在切片表面，然后以100微米的步長進入皮層III-IV層，深度約為300微米。每前進一步，先讓氧氣水平穩定下來，然后再讀取讀數并進行下一步調整。氧信號以5Hz的采樣率連續記錄。

皮層切片實驗方案3：長時間（5小時）接觸藻類：

這組實驗的目的是確定長期接觸海藻是否會對大腦皮層神經生理學產生毒性影響。

按上述方法制備一只動物的切片（n=6）。將每只動物的三片切片分別放入裝有無鎂aCSF和無鎂aCSF中藻類培養液的靜態室（約200mL）中。為防止藻類沉淀，兩個室都用室內空氣充氣，充氣量約為300mL/min。兩個培養室都沒有進行外部充氧。藻類室從上方用14瓦的白色發光二極管照明，距離5-10厘米。定期測量藻室中的氧氣含量。

將每片切片從試驗室中取出，在記錄槽中灌注（5mL/min）無鎂aCSF。記錄六個位置，每個半球三個，大致等距。每個位置至少記錄五個SLE。如果在3分鐘內沒有SLE或在10分鐘內SLE少于5個，則認為該部位處于非活動狀態。2小時測試后，將切片放回各自的腔室，5小時后再次測試。

數據分析：

切片性能通過量化三個SLE參數來評估：長度、振幅和事件頻率。缺氧導致的組織功能衰退表現為SLE更小、頻率更低。長度和振幅按四個連續事件的平均值計算。根據原始記錄量化2分鐘內的SLE頻率。通過計算50秒窗口內原始波形的平均絕對電壓來量化組織活動的整體度量，事件間期歸一化為零。這實際上給出了電壓波形下的平均面積，將SLE振幅、頻率和長度整合為一個單一指標，我們稱之為"整體"活動。

采用重復測量方差分析（正態分布數據）和弗里德曼檢驗（非正態分布數據）對多組比較的系統性紅斑狼瘡參數進行檢驗。配對比較采用Wilcoxon檢驗（正態分布數據）和配對t檢驗（非正態分布數據）。p值小于0.05即為具有統計學意義。